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近年來(lái)，下一代測(cè)序技術(shù)（NGS）越來(lái)越受到診斷實(shí)驗(yàn)室的歡迎，然而，基于NGS的診斷還面臨著很多障礙。近日，Nature子刊《European Journal of Human Genetics》雜志以BRCA為例，從診斷實(shí)驗(yàn)室角度闡述了基因檢測(cè)面臨的新挑戰(zhàn)。
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大規(guī)模并行測(cè)序技術(shù)和NGS平臺(tái)的快速發(fā)展，使遺傳性疾病的管理發(fā)生了顛覆性變化。多數(shù)基因檢測(cè)早期臨床研究表明，與現(xiàn)有方法相比，NGS可提供一種高靈敏度、高特異性以及高成本效益的診斷手段，目前，NGS在臨床上越來(lái)越吸引診斷實(shí)驗(yàn)室。
隨著基因檢測(cè)的需求增加，診斷實(shí)驗(yàn)室面臨的壓力越來(lái)越大，他們需要不斷提高基因突變的篩查能力，且明確變體的臨床意義仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)，同時(shí)基因檢測(cè)流程的復(fù)雜性增加了NGS診斷的難度，其中包括NGS平臺(tái)、富集方法以及生物信息分析的復(fù)雜性等。
高效、高性?xún)r(jià)比的突變檢測(cè)方法以及標(biāo)準(zhǔn)化、系統(tǒng)性的NGS檢測(cè)報(bào)告是診斷的基本要求。近日，Nature子刊《European Journal of Human Genetics》雜志從診斷實(shí)驗(yàn)室角度闡述了BRCA基因檢測(cè)面臨的新挑戰(zhàn)。
挑戰(zhàn)一：測(cè)序平臺(tái)的選擇
隨著技術(shù)的發(fā)展，NGS平臺(tái)能在較短的運(yùn)行時(shí)間（<24H）內(nèi)實(shí)現(xiàn)gigabase大規(guī)模的DNA測(cè)序，例如Illumina的Miseq和Life Technologies的PGM。
MiSeq通過(guò)將基因組DNA的隨機(jī)片斷附著到光學(xué)透明的表面，這些DNA片斷通過(guò)延長(zhǎng)和橋梁擴(kuò)增，形成了具有數(shù)以?xún)|計(jì)cluster的Flowcell，每個(gè)cluster具有約1000拷貝的相同DNA模板，然后用4種末端被封閉的不同熒光標(biāo)記的堿基進(jìn)行邊合成邊測(cè)序。
Life Technologies公司的Ion Personal Genome Machine (PGM™) 測(cè)序儀
Ion Torrent PGM使用了一種高密度半導(dǎo)體小孔芯片。該芯片置于一個(gè)離子敏感層和離子感受器之上，每當(dāng)有核苷酸分子被摻入時(shí)就會(huì)釋放出質(zhì)子，而離子感受器就會(huì)感受到這種信號(hào)，知道是哪一個(gè)核苷酸被摻入，從而讀出DNA序列。
測(cè)序平臺(tái)的快速發(fā)展使得一些出版物的陳述有些過(guò)時(shí)，鑒于此，診斷實(shí)驗(yàn)室在選擇NGS平臺(tái)時(shí)，應(yīng)該關(guān)注平臺(tái)的更新，其中包括分子生態(tài)學(xué)家等對(duì)指南的更新。
然而，平臺(tái)的選擇只是NGS工作流程中需要考慮的因素之一，該因素與其他因素相互依賴(lài)，包括富集方法和數(shù)據(jù)分析等。
挑戰(zhàn)二：富集方法
與全基因組相比，NGS在臨床上通常被用于檢測(cè)特異性基因，如BRCA1和BRCA2基因。因?yàn)镹GS捕獲和檢測(cè)特異性基因的成本及時(shí)間效益會(huì)更高，這也推動(dòng)了多種富集方法的發(fā)展，目前最常用的富集方法依賴(lài)于PCR或雜交技術(shù)。然而，每種技術(shù)都有一定的優(yōu)劣勢(shì)。
PCR是一種行之有效的測(cè)序前富集技術(shù)，尤其是用于Sanger測(cè)序平臺(tái)。對(duì)于NGS平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)室已成功開(kāi)發(fā)出用于BRCA基因檢測(cè)的長(zhǎng)片斷PCR技術(shù)。然而，為了充分利用NGS的高通量特性，實(shí)驗(yàn)人員往往會(huì)準(zhǔn)備大量的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，這就導(dǎo)致了對(duì)于一個(gè)特定基因或基因Panel，市場(chǎng)上會(huì)發(fā)展起多個(gè)多重PCR試劑盒，例如，用于BRCA檢測(cè)的多重PCR試劑盒就有Multiplicom公司的CE-IVD BRCA MASTR、賽默飛的Ion Ampliseq Community Panel 以及德國(guó)Qiagen的 GeneRead DNASeq等。雖然PCR作為高靈敏度和高特異性的富集技術(shù)，但應(yīng)用在大規(guī)?；蚪M靶標(biāo)檢測(cè)時(shí)卻十分低效。
雜交富集方法具有高度可擴(kuò)展性等優(yōu)點(diǎn)，目前市場(chǎng)上也有多種基于該技術(shù)的BRCA檢測(cè)試劑盒，例如Agilent公司的HaloPlex和SureSelect，此外市場(chǎng)上還有包含BRCA基因在內(nèi)的多種癌癥基因panel檢測(cè)試劑盒，例如Illumina開(kāi)發(fā)了針對(duì)94個(gè)基因的試劑盒，羅氏開(kāi)發(fā)了針對(duì)578個(gè)基因的試劑盒。然而，值得指出的是，當(dāng)基因panel較寬泛時(shí)，雜交技術(shù)尤其是微陣列捕獲技術(shù)可能會(huì)增加額外的成本以及時(shí)間。
挑戰(zhàn)三：生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)
NGS檢測(cè)產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)需進(jìn)行生物信息學(xué)分析、變體識(shí)別（variant call）以及數(shù)據(jù)篩查后才能使用。對(duì)于NGS數(shù)據(jù)分析，診斷實(shí)驗(yàn)室有多種選擇，然而，要獲取具有臨床價(jià)值的可靠數(shù)據(jù)，選擇合適的分析軟件和全面驗(yàn)證至關(guān)重要。
目前市場(chǎng)上的商用分析軟件有 NextGENe、CLC Workbench 以及一些與具體測(cè)序平臺(tái)相連的軟件，例如Life Technologies的Torrent Suite Software Plugins等。一些開(kāi)放的生物信息學(xué)軟件可用來(lái)創(chuàng)建自定義生物信息學(xué)分析途徑，例如， Pindel、VarScan、GATK-lite 和Samtools。然而，值得注意的是，從醫(yī)學(xué)分析水平來(lái)看，從生物信息學(xué)到NGS診斷還面臨很大的挑戰(zhàn)。
追蹤和管理NGS臨床樣本需要一個(gè)實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS），該系統(tǒng)既支持NGS、適合診斷實(shí)驗(yàn)室的需求，又能靈活適應(yīng)檢測(cè)的變化。目前可用的商用系統(tǒng)數(shù)量繁多，其中一些系統(tǒng)主要針對(duì)NGS平臺(tái)的管理，例如 Exemplar LIMS、Clarity LIMS和 Sequencing LIMS 等。然而，商用系統(tǒng)往往需要較高的安裝成本和大量的配置才能解決實(shí)驗(yàn)室的具體需求。不過(guò)，目前也存在一些開(kāi)放的系統(tǒng)如Galaxy LIMS 。
挑戰(zhàn)四：大范圍的基因組重排（LGRs）和臨床意義不明的變體（VUS）
目前，深度測(cè)序法及末端配對(duì)測(cè)序法已被應(yīng)用于癌癥DNA的LGRs（large genomic rearrangements）檢測(cè)。從NGS數(shù)據(jù)中選出LGRs受限于富集方法，PCR富集方法目前不適用于拷貝數(shù)變異（CNVs）的檢測(cè)，但雜交富集方法在此方面具有一定的潛力。
然而，這類(lèi)檢測(cè)均需要專(zhuān)業(yè)的生物信息學(xué)分析，且小CNVs的檢測(cè)面臨著一些特定的問(wèn)題，如靈敏度較低等。在NGS能常規(guī)應(yīng)用于臨床上的CNV綜合檢測(cè)之前，必須先通過(guò)大量的臨床驗(yàn)證。
VUS是數(shù)據(jù)分析時(shí)常見(jiàn)的現(xiàn)象，目前國(guó)際上不斷發(fā)起數(shù)據(jù)共享聯(lián)盟，旨在推進(jìn)測(cè)序方法的發(fā)展以及改進(jìn)基因的變異分類(lèi)。然而，值得注意的是，由于變異水平的差異，分析人員在使用公共突變數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎。
總結(jié)
隨著基因檢測(cè)的需求增加，診斷實(shí)驗(yàn)室需要適應(yīng)當(dāng)前的檢測(cè)策略及技術(shù)的發(fā)展。NGS的使用不僅可以滿(mǎn)足不斷上漲的檢測(cè)需求，還能降低整體成本等。然而，NGS的選擇復(fù)雜性需綜合考慮多個(gè)相互依存的因素。對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的解釋?zhuān)绕涫墙忉屌R床意義不明確的變體時(shí)，需要進(jìn)行全面且系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，還需要有明確的報(bào)告，此外診斷實(shí)驗(yàn)室還需意識(shí)到腫瘤DNA檢測(cè)面臨著重大挑戰(zhàn)。
備注：本文根據(jù)European Journal of Human Genetics網(wǎng)站編譯，原文鏈接為New challenges for BRCA testing: a view from the diagnostic laboratory
