比如，當(dāng)來自博德研究所的研究人員Aviv Regev等人利用scRNA-seq對2400個免疫系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)行探查時，他們無意中發(fā)現(xiàn)了一些具有潛在T細(xì)胞激活活性的樹突狀細(xì)胞，Regev表示，一種刺激這些細(xì)胞的疫苗或能夠潛在增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)并且保護(hù)機(jī)體抵御癌癥。當(dāng)然了，這些發(fā)現(xiàn)都是來之不易的，相比大量細(xì)胞而言，研究人員很難對單個細(xì)胞進(jìn)行操作，因為每一種細(xì)胞僅會產(chǎn)生少量的RNA，對于研究者而言沒有犯錯的余地；另外一個問題就是如何對大量的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最重要的是，研究者使用的工具可能是并不直觀的。
圖片來源：www.nature.com
一般而言，RNA測序數(shù)據(jù)能夠被以指令的形式輸入到Unix操作系統(tǒng)中進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)文件會從一個軟件包傳輸?shù)搅硗庖粋€，在這個過程中，每個工具都要對每一個步驟進(jìn)行處理，比如基因組比對、質(zhì)量控制、識別突變體等等。這個過程是非常復(fù)雜的，但對于大量的RNA-seq而言，研究人員可以利用算法對每一個步驟進(jìn)行處理，而且他們也非常清楚每個過程的運(yùn)行狀況。
如今網(wǎng)上有很多在線資源和工具能夠簡化scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的過程，其中名為GitHub的平臺（Awesome Single Cell）就整合了70多種工具和資源，而且相關(guān)的工具和資源能夠覆蓋分析過程的每一步。
定制技術(shù)
在2016年發(fā)表的一篇研究報告中，來自夏威夷大學(xué)的生物信息學(xué)家Lana Garmire就列出了他們進(jìn)行scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的基本步驟，盡管每一個實(shí)驗都具有特殊性，但很多分析流程都是按照相同的步驟進(jìn)行過濾以及對數(shù)據(jù)進(jìn)行排序的，同時還能夠找出哪些轉(zhuǎn)錄物會被表達(dá)并且能夠糾正擴(kuò)增效率的差異性，隨后研究人員就能夠進(jìn)行一個或多個二級分析來檢測亞群和其它功能。
研究人員所面臨的另外一項挑戰(zhàn)就是規(guī)模問題，經(jīng)典的RNA-seq實(shí)驗往往包含了少量樣本，但scRNA-seq研究中則含有成千上萬個樣本，能夠處理少量樣本的工具當(dāng)遭遇十倍甚至百倍的樣本時，其效率通常就會降低。比如一種最常見的單細(xì)胞分析類型就是維數(shù)約減（dimensionality reduction），這一過程就能夠簡化數(shù)據(jù)集來促進(jìn)對相同細(xì)胞的識別；桑格學(xué)院研究所的計算機(jī)生物學(xué)家Martin Hemberg認(rèn)為，scRNA-seq數(shù)據(jù)能夠把每一個細(xì)胞描繪成為“具有20000個基因表達(dá)值的一覽表”。而諸如主成分分析法（PCA）和t-分布鄰域嵌入算法(t-SNE algorithm)等維數(shù)約減算法則能夠有效地將這些形狀投射到兩個或三個維度，從而就能夠使得相似的細(xì)胞聚集在一起。另外一種流行的應(yīng)用就是偽時分析，2014年研究人員就開發(fā)了一種名為Monocle的工具，該工具能夠利用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法來對scRNA-seq實(shí)驗性的數(shù)據(jù)進(jìn)行推斷。
當(dāng)然，諸如Pagoda等其它工具還能夠解決亞群特征檢測和空間位置確定等信息，其能夠利用組織中基因表達(dá)的分布數(shù)據(jù)來確定每一個組織中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)表達(dá)情況；來自紐約基因組研究中心的研究者Rahul Satija就開發(fā)了一種名為Seurat的工具，該工具能夠利用這些數(shù)據(jù)將細(xì)胞定位在三維空間中的點(diǎn)。
如今，研究人員已經(jīng)開發(fā)出了一些即用型的檢測“流水線”，當(dāng)然還有一些端對端的圖像工具，包括一些商業(yè)性的SeqGeq包以及一些成對兒的網(wǎng)絡(luò)開放性工具，比如Granatum和ASAP（自動的單細(xì)胞分析流水線，the Automated Single-cell Analysis Pipeline）；Granatum和ASAP能夠利用網(wǎng)絡(luò)瀏覽器提供相對簡單、交互式的工作站來幫助科學(xué)家們以圖形化的模式來深度分析數(shù)據(jù)；目前這兩個工具能夠更好地幫助科學(xué)家們進(jìn)行日常的測序工作。
圖片來源：www.nature.com
使用工具時需要警惕
這些工具并不是在每一種情況下都是完美的，比如一種能夠善于精確鑒別細(xì)胞類型的“流水線”或許在進(jìn)行偽時間分析（pseudo-time analysis）上并不擅長；此外，一些適當(dāng)?shù)姆椒ɑ蛟S還具有一定的數(shù)據(jù)依賴性。
對于初學(xué)者而言，嚴(yán)謹(jǐn)是非常必要的，生物信息學(xué)工具幾乎總是能夠給出一個答案，那么問題是，這些答案意味著什么呢？來自加利福尼亞大學(xué)的研究者Sandrine Dudoit的建議就是進(jìn)行一些探索性的分析，同時對我們選擇的算法進(jìn)行一些假設(shè)性的研究。有些分析性的任務(wù)仍然極具挑戰(zhàn)性，包括將來自實(shí)驗條件下或有機(jī)體中的數(shù)據(jù)同來自不同組學(xué)整合的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比。
目前研究人員能夠使用足夠多的工具來進(jìn)行研究，而那些對其感興趣的科學(xué)家也在不斷鉆研；每一種新型工具都能夠揭示生物學(xué)的另一面，因此只要時刻關(guān)注科學(xué)，我們就能夠做出明確的選擇。
參考資料：
【1】Single-cell sequencing made simple
【2】Single-Cell Transcriptomics Bioinformatics and Computational Challenges
Front. Genet doi：10.3389/fgene.2016.00163
【3】How to build a human cell atlas
【4】Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells， monocytes， and progenitors
Science DOI： 10.1126/science.aah4573
