作者 李召 陳志偉 任紅 胡鵬
重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院感染科
丙型肝炎病毒（HCV）感染仍然是威脅人類健康的主要疾病之一。在2011年之前，其治療方案主要是聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林，但是治療效果有限，且有相當一部分人不能耐受。自2011年第一個直接抗病毒藥物（DAAs）的問世以來，HCV感染的治療開啟了新的篇章。
DAAs通過阻斷HCV生活周期中特異性的蛋白或酶來發(fā)揮其抗病毒作用，主要分為4類：（1）NS3/4A蛋白酶抑制劑（PIs）：作用于NS3/4A蛋白酶的活性位點；（2）NS5A抑制劑：同NS5A二聚體的1區(qū)相互作用，然而其確切的作用機制仍不清楚；（3）NS5B核苷酸類似物抑制劑：通過插入到新生RNA鏈并導致鏈終止，損害下一個進入的核苷酸的結合發(fā)揮作用；（4）NS5B非核苷酸類似物抑制劑：與NS5B拇指1，拇指2，手掌1或手掌2區(qū)結構域相互作用并通過變構作用機制抑制聚合酶活性。
DAAs用于慢性HCV感染的治療有著較高的持續(xù)病毒學應答率（SVR），良好的耐受性和安全性。但是，值得注意的是，仍有相當數(shù)量的患者（1%～15%）不能清除病毒感染。而HCV耐藥相關突變（RAVs）在這些病毒學治療失敗中起了重要作用,其對DAAs治療結局的影響也受到廣泛關注。
一、DAAs耐藥相關突變的定義
HCV是一種單股正鏈的RNA病毒，由于HCV RNA聚合酶的低保真性，病毒基因組的錯配率非常高，加上病毒復制生成的速度較快，導致HCV在患者體內(nèi)形成遺傳上不同卻又密切相近的一群復雜HCV群體，稱之為"準種" 。其中一些準種突變就發(fā)生在藥物作用的靶基因上，而其中某些特定的突變就會引起DAAs的敏感性下降，稱為RAVs。這也提示我們，有些RAVs在接受DAAs治療前就已存在。此外，在接受DAAs治療的過程中，由于藥物的選擇壓力，也可促使病毒產(chǎn)生新的對抗該藥物的耐藥相關突變。
二、已知耐藥突變及其流行率
1．NS3/4A蛋白酶抑制劑的RAVs：
目前已被批準上市的NS3/4A PIs有telaprevir，boceprevir, simeprevir，paritaprevir, grazoprevir。PIs具有相對較低的耐藥屏障，導致第一代PI sboceprevir和telaprevir治療失敗的常見耐藥位點有V36A/M、T54A/S、V55A、Q80R/K、R155K/T、A156S/T/V、I/V170A和D168A/E/K/T/V/Y，同時第一代PI具有廣泛的交叉耐藥，涉及的氨基酸位點有V36、T54、R155和A156，其中A156S/T/V被確定高水平耐藥。最近研發(fā)的PIs simeprevir、paritaprevir、grazoprevir提高了其耐藥的基因屏障和針對不同基因型的抗病毒活性，但R155和D168位點的氨基酸替代仍能大幅度的降低其抗病毒活性。此外，GT1a亞型患者最常見的RAVs為Q80K[相對于GT1b亞型29.5% （269/911）比0.5%（5/1096）],并且Q80K的流行具有地域性的差異：北美48.1% （185/385），歐洲19.4%（73/377），南美9.1% （2/22）。其他NS3/4A相對少見的RAVs的流行率：Q80G 0.05%，Q80L 1.9%，Q80N 0.05%，Q80R 0.6%，R155K 0.3%，D168E 0.4%，Q80K+D168E 0.05%。
2．NS5A抑制劑的RAVs：
迄今被批準上市的第一代NS5A抑制劑(daclatasvir, ledipasvir, ombitasvir)對耐藥具有較低的基因屏障和廣泛的交叉耐藥。而第二代NS5A抑制劑elbasvir顯示出較高的基因屏障。NS5A抑制劑整體顯示出較廣泛的基因型覆蓋性。最常見的耐藥相關氨基酸替代位點為：M/L28T/V、Q/L30E/H/R/S、L31M/V、H58D和Y93C/H/N。它們自然出現(xiàn)的頻率波動在0.3%～2.8%。值得注意的是，有85%的DAAs治療失敗的患者在1～2年后HCV仍能檢測出RAVs。
3．NS5B聚合酶抑制劑的RAVs：
Sofosbuvir是目前被批準上市的NS5B核苷酸類似物抑制劑，顯示出極高的基因屏障，在所有單藥或者與其他DAAs聯(lián)合治療的臨床試驗中，均沒有出現(xiàn)病毒學突破。Sofosbuvir的耐藥相關突變主要有：S282T/G/C/R，M289L，I293L，C316N，V321A，I434M，L159F/L320F，T179A。自然存在的針對sofosbuvir的RAVs至今未被發(fā)現(xiàn)，可能是由于S282T的變異能顯著損害病毒的復制能力，這也解釋了為什么在其治療過程中沒有出現(xiàn)病毒學突破。而當病毒出現(xiàn)S282S突變以及補償性突變M343T和H479P時，可恢復病毒的復制能力。
Dasabuvir是目前被批準的唯一的NS5B非核苷類似物抑制劑，具有較低的基因屏障?？偟恼f來，在GT1型的患者中，dasabuvir相關的預存RAVs率約0.2%～3.1%。但是，值得注意的是，在GT1b型患者中，C316N檢出率卻高達10%～35% 。此外，針對dasabuvir的RAVs在患者體內(nèi)可存活時間較長，有文獻報道，在dasabuvir結束治療后的6個月和12個月仍有75%和57%的患者可以檢測到RAVs。
三、耐藥突變與臨床的關系
在臨床上，耐藥突變對初治患者以及經(jīng)治患者DAAs療效的影響仍然是值得我們探討的重要問題。
1．初治患者：
在DAAs初治的患者中，對NS3/4A、NS5A和NS5B抑制劑的預存耐藥均有被報道。在無干擾素各種DAAs聯(lián)合治療方案的Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗顯示,不會顯著損害病毒復制能力的中到高水平耐藥的RAVs在基線占有較大比例（>15%的HCV準種）會影響以DAA為基礎的聯(lián)合治療方案的病毒學結局。在simeprevir+ sofosbuvir±ribavirin治療GT1a型肝硬化患者的臨床試驗中，基線存在Q80K多態(tài)性的患者其SVR率顯著低于無突變者(74%比92%）。而在OCCASIONAL研究中也發(fā)現(xiàn)預存R155K/T/Q的多態(tài)性與GT1a型患者的治療失敗相關。最近有一篇6個臨床試驗的聚類分析顯示，GT1b型患者接受asunaprevir+daclatasvir治療24周，NS5A基線耐藥相關變異L31F/I/M/V和Y93H的出現(xiàn)會分別對SVR產(chǎn)生影響[42%（18/43）比88%（824/936）]和[37%（38/103）比92%（804/876）]。此外，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）進行的一項研究顯示，GT1b的患者擁有NS5B-C316N的變異與sofosbuvir聯(lián)合利巴韋林的治療失敗相關。然而，也有一些臨床試驗并沒有發(fā)現(xiàn)基線RAVs對DAAs治療效果有明顯的影響。
2．經(jīng)治患者：
在經(jīng)歷過DAAs治療失敗的患者中，幾乎均能發(fā)現(xiàn)與其治療失敗相關的DAAs耐藥相關突變。在HBV和HIV的治療過程中，相關的RAVs會在患者體內(nèi)富集并持續(xù)存在，導致后續(xù)的治療失敗。而在HCV中，NS3/4耐藥突變消失得最快（24～48周），其次是NS5B，最后是NS5A（數(shù)月到數(shù)年）。有文獻報道，接受sofosbuvir/ledipasvir治療的患者在8周或者12周沒有獲得SVR，同樣的治療方案延長至24周結果仍然不理想。而通過改變DAAs聯(lián)合方案再治療的策略在一些小型研究中卻表現(xiàn)出較好的效果。例如，daclatasvir為基礎的治療方案失敗的15例患者，在接受sofosbuvir + simeprevir的聯(lián)合方案再治療后，87% (13/15)的患者獲得SVR。而經(jīng)歷過包含boceprevir或telaprevir的三聯(lián)治療失敗的患者，接受sofosbuvir + daclatavir或者sofosbuvir + ledipasvir再治療后，其SVR率可高達94%～100%，并且與NS3 RAVs的是否出現(xiàn)無關。還有研究顯示，8例晚期肝硬化的患者接受各種DAAs聯(lián)合方案治療12周，均不能獲得SVR，然后接受sofosbuvir + daclatasvir + simeprevir + ribavirin再治療24周，75%的患者獲得了SVR。因此，這些結果表明對于DAAs治療失敗的患者，包括那些攜帶RAVs的患者,更換為強效高耐藥屏障的DAAs聯(lián)合應當被考慮，如sofosbuvir與1～3種其他DAA的組合。建議在有不良反應因素的患者（如肝硬化患者）加入利巴韋林和（或）延長治療持續(xù)時間至24周。密切的患者隨訪也是必須的，因為多藥聯(lián)合的安全性是未知的。如果不是緊急的需要再治療，等待更好新藥或方案是個不錯的選擇。
四、耐藥檢測的臨床意義
HIV/HBV的治療經(jīng)驗告訴我們，耐藥的出現(xiàn)會嚴重影響其治療結局。而在HCV中，也有不少研究發(fā)現(xiàn)RAVs會影響其治療的SVR，因此臨床耐藥檢測在初次治療之前，治療失敗時和再次進行DAAs治療前的意義仍有待闡明。不像HIV的臨床耐藥檢測有標準化商品化的試劑盒，HCV的臨床耐藥檢測方法主要有普通測序法和深度測序法，主要依靠各病毒實驗室內(nèi)部的技術。所以對其結果的解釋也是一個挑戰(zhàn)，因為不同實驗室其普通測序的敏感性不一樣。而且深度測序的截斷值也沒有標準化，畢竟不是所有的RAVs都有臨床意義，這取決于RAVs在病毒準種中所占的比例和在相同或者不同區(qū)段的其他RAVs的出現(xiàn)。由于HCV耐藥檢測在臨床廣泛使用的條件仍不成熟，所以在初次治療之前進行系統(tǒng)的HCV耐藥檢測是不被推薦的。而是可以通過一些治療策略的優(yōu)化來獲得初次治療的高SVR率。對于檢測出含有能降低療效的NS5A RAVs的肝硬化患者，指南推薦利巴韋林聯(lián)合sofosbuvir/ledipasvir或者sofosbuvir + daclatasvir，或者選用sofosbuvir + simeprevir治療12周或者延長療程至24周以降低治療失敗率。此外，對于治療失敗的患者，在病毒學突破當時進行耐藥檢測不會獲得有用信息，因為此時存在大量的RAVs。而對DAAs經(jīng)治患者進行再治療時，耐藥檢測也不是絕對必須的，但卻可以指導再治療策略的制定。
五、展望
綜上所述，DAAs耐藥仍是一個臨床上值得關注的問題。RAVs對慢性HCV感染患者接受DAAs治療的臨床結局有一定影響，但仍待進一步大樣本臨床試驗結果的驗證。就目前而言，提高對DAAs耐藥突變的重視，對規(guī)范和優(yōu)化選擇DAAs初治和經(jīng)治方案是很有必要的。
中華肝臟病雜志, 2017,25(03): 170-174.
